石家莊白求恩國際和平醫(yī)院燒傷整形科  楊建民 王鵬 史少蕊

干細胞中心  王更銀 李俊峽

石家莊市第一醫(yī)院整形美容中心 劉坤坤 劉超 賈玉磊

【摘要】

目的：研究臍帶間充質干細胞（UCNSC）和人汗腺細胞（SGC）合核細胞的生物學特性，為汗腺再生探索新的方法和途徑。方法：（1）體外分離培養(yǎng)UCNSC和SGC，通過檢測CD14、CD44、CD29、CD105、CD34、CD45表達情況鑒定UCNSC，檢測CK19、CEA表達情況鑒定SGC。（2）制取、檢測間充質干細胞/汗腺細胞合核細胞，用PKH26、CFSE分別對UCNSC、SGC進行標記，用聚乙二醇（PFG）化學融合法制備間充質干細胞/汗腺細胞融合體，通過熒光顯微鏡熒光觀察篩選融合細胞后繼續(xù)培養(yǎng)：1周后流式細胞儀檢測合核細胞中CD14、CD44、CD29、CD34、CD45表達率，免疫組織化學檢測CK19、CEA表達情況。結果：間充質干細胞/汗腺細合核細胞的免疫組化檢測CEA和CK19表面抗原均為陽性，流式細胞術檢測表面標志物CD29、CD44、CD105表達率較高。結論：誘導融合后的間充質干細胞/汗腺細胞合核細胞同時具備干細胞合汗腺細胞的表型。

【關鍵詞】間充質干細胞；汗腺干細胞；融合細胞；再生；聚乙二醇化學融合法

大面積嚴重燒傷使創(chuàng)面皮膚附屬器官被破壞，喪失了正常分泌汗液、調(diào)節(jié)體溫的功能，使患者的生活質量降低。如何解決汗腺的再生問題已成為當今研究的熱點。本研究利用細胞融合技術使人臍帶間充質干細胞和汗腺細胞融合產(chǎn)生合核細胞，理論上合核細胞保留了干細胞的可擴增特性和汗腺細胞的分泌汗液特性，為燒傷后汗腺再生提供新方法和途徑。

1.材料與方法

1.1標本來源

臍帶組織來自本院婦產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)的健康胎兒臍帶，全層皮膚來自于本院燒傷整形科頭部皮膚擴張器Ⅱ期術后的多余正常皮膚。所有標本均在無菌條件下收集處理，使用時均獲得產(chǎn)婦及家屬知情同意，并簽署同意書。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基購自Hyclone公司，10%胎牛血清（PBS）購自Gibco公司、重組表皮細胞生長因子（EGF）購自Pepro Tech公司，三碘甲狀腺原氨酸（T3）、胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉（ITS）、PKH26細胞染色試劑盒購自美國Sigma公司，琥珀酰氫化考的松購自Calbipchem公司，胰蛋白酶/EDTA消化液自Solarbio公司，GEP細胞融合實際盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，CFDA SE細胞增殖與失蹤檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.3臍帶間充質干細胞的獲得及其標記

用組織塊培養(yǎng)法獲得UCMSC，將二代臍帶間充質干細胞制成單細胞懸液，離心、取沉淀，用稀釋液C重懸細胞后，放入PKH26工作液中染色1-5min，血清終止反應，DMEM/F12完全培養(yǎng)基洗滌2次后正常培養(yǎng)（具體操作步驟按說明書進行）。熒光顯微鏡下觀察標記效果。倒置相差顯微鏡下觀察標記后細胞形態(tài)。

1.4人汗腺細胞的獲得及標記

用膠原酶消化法獲得SGC，將一代汗腺細胞消制單細胞懸液，離心、取沉淀，加入CFDA細胞標記液和CFDA SE儲存液（2X）進行標記，完全培養(yǎng)液（含血清）終止標記，洗滌三次后正常培養(yǎng)（具體操作按說明書進行）。在熒光顯微鏡下觀察標記效果。

1.5 間充質干細胞/汗腺細胞融合及篩選

融合方法：分別取對數(shù)生長期已標記的P3代臍帶間充質干細胞和已標記的P0代汗腺細胞，傳代24小時候用5mlGENMED清理液（reagentA）清洗，分別加入4×10⁶的兩個父代細胞到一個50ml錐形離心管，300×g離心10min，去上清后用10ml GENMED清理液（reagentA）洗滌一次，取細胞沉淀加入105ml GENMED融合液（reagent B）混勻，置室溫下1min，用10ml GENMED清理液（reagentA）洗滌一次，去上清后正常培養(yǎng)（具體操作步驟按說明書進行）。在倒置相差顯微鏡下觀察融合后細胞形態(tài)。

篩選方法：換液后調(diào)整細胞為1~5個細胞/ml；取96孔板，每孔加入細胞懸液200μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中；待細胞貼壁后，在熒光顯微鏡下標記出同時顯影紅色熒光和綠色熒光的孔，將標記孔內(nèi)的細胞收集后培養(yǎng)，視細胞生長情況檢測并擴大培養(yǎng)。

1.5觀察指標

間充質干細胞和人汗腺細胞，分別進行流式細胞儀、免疫組織化學檢測；培養(yǎng)1周后的合核細胞同時行流式細胞儀和免疫組織化學檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理

利用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，檢驗標準a=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 UC-MSCs分離、培養(yǎng)基鑒定

培養(yǎng)1周后可見較多UCMSC呈梭形成纖維樣細胞生長；2周后達80%融合，傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)良好，流式細胞術結果顯示，對分離培養(yǎng)的UC-MSCs進行流式細胞術檢測，干細胞表面標志物CD29、CD44、CD105表達率較高，分別為99.9%、99.8%、95.7%；造血干細胞表面標志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達，分別為0.0%、0.2%、0.2%。提示本實驗分離、培養(yǎng)的細胞是交純化的間充質干細胞，可以用于實驗研究，PKH26標記后的間充質干細胞在熒光顯微鏡下觀，細胞呈現(xiàn)紅色熒光，染色較均勻，細胞貼壁好（圖1）

圖1 PKH26標記后的間充質干細胞

現(xiàn)紅色熒光 熒光顯微鏡×300

2.2 汗腺細胞（h-SGCs）的培養(yǎng)

培養(yǎng)7天后，已有汗腺貼壁，鏡下可見少量汗腺團塊周圍爬出不規(guī)則形細胞，呈集落狀生長；10天后，鏡下可見汗腺團塊周圍爬滿不規(guī)則細胞，呈鋪路石樣生長，CEA和CK19表面抗原檢測為陽性（圖2），CFDA SE標記后的汗腺細胞在熒光顯微鏡下觀，呈現(xiàn)為綠色熒光，染色較均勻（圖3）。

圖2 培養(yǎng)10天后的汗腺細胞成鋪路

石樣 倒置相差顯微鏡×40

圖3 FDA SE 標記的汗腺細胞呈現(xiàn)

為綠色熒光  熒光顯微鏡×300

2.3

干細胞/汗腺細胞融合細胞的篩選、鑒定；在熒光顯微鏡下融合細胞同時顯示紅色熒光和綠色熒光，紅色熒光主要分布在細胞膜，綠色熒光主要在細胞質尤其是細胞核附近。融合細胞高表達部分干細胞表面標志物CD29、CD44、CD105表達率分別為69.1%、64.1%、99.0%（圖4），融合細胞CEA和CK19表面抗原檢測為陽性（圖5）

 圖4 融合細胞高表達部分干細胞表面標志物CD29、CD44、CD105，表達率分別為69.1%、64.1%、99.0%

圖5  免疫組織化學檢測融合細胞CEA合CK19表面抗原為陽性

2.4

統(tǒng)計學分析；融合細胞CEA合CK19陽性率分別為78%和85%，對照組CEA和CK19的陽性率分別為7.5%和3.5%（P<0.05）有明顯統(tǒng)計學差異（見表1）。同時以上實驗結果提示此次試驗分離、培養(yǎng)、誘導融合的干細胞/汗腺細胞融合體同時具有部分干細胞的生物學特性和汗腺細胞的生物學特性。

表1 對照組和實驗組免疫組化染色CEA和CK19表達情況比較（% `x±s)

與對照組比較：*P<0.05

討論

大面積深度燒傷幸存者因汗腺損毀或瘢痕增生，使皮膚喪失了正常分泌汗液、調(diào)節(jié)體溫的功能，嚴重影響患者的生活質量[1]。無論是應用自體皮片或普通組織工程皮移植創(chuàng)面均無法使汗腺再生，因此如何實現(xiàn)大面積深度燒傷創(chuàng)面汗腺的重建，成為目前亟待解決的難題。

隨著再生醫(yī)學深入發(fā)展，為解決以上難題提供了新的思路。細胞融合最早是Barski等于1961年首次發(fā)現(xiàn)，此后相繼研究處3類成熟的細胞融合技術：①生物法：滅火病毒誘導細胞融合。②化學法：聚乙二醇（PEG）誘導細胞融合③物理法：電脈沖誘導細胞融合和激光誘導細胞融合[2-4]、從理論上可以說利用細胞融合技術可以使任何兩個細胞通過體細胞雜交融合而形成新的生物資源，它是繼基因工程技術出現(xiàn)并發(fā)展以來一種更為有效轉移遺傳物質的手段[5]。本次試驗中將間充質干細胞與汗腺細胞雜交融合形成了新的資源，我們得到了一種既能快速擴增，又能分泌汗腺的細胞。

人臍帶間充質干細胞UC-MSCs作為試驗中父代細胞之一是因為其具有來源充足，獲取時無創(chuàng)。原代培養(yǎng)容易，純度高等特點[6-8]，更重要的是UC-MSCs抗原性低，免疫系統(tǒng)排斥小，同原始細胞更加接近，可作為臨床上各種異體間移植的重要干細胞來源[9-10]。這利于將融合細胞用于同種異體尖移植為以后臨床實驗打基礎。本次實驗用于干細胞取代腫瘤細胞，作為父代細胞，這使得容二虎細胞移植到人體成為可能，也為其他融合實驗提供了一種新的思路，而且與有免疫缺陷的重力細胞株相比，MSCs來源豐富、分離培養(yǎng)相對簡單[11-13]。

汗腺細胞的特異性抗原標志物還沒有發(fā)現(xiàn)。但研究發(fā)現(xiàn)CEA，在胎兒和成人皮膚的汗腺導管部、分泌部均有表達，在胎兒的小汗腺中也有表達，在表皮的其他部位不表達。CK19是上皮細胞的特異性抗原標志物，在汗腺細胞中也有表達。因此，本實驗用CEA與CK19作為汗腺細胞的表面標志物進行免疫組織組化檢測。

間充質干細胞和汗腺融合的現(xiàn)象在國外早有報道，2005年我國學者在國內(nèi)首次報道了間充質干細胞和汗腺細胞融體，并做了相關檢驗證明融合體同時表達間充質干細胞和汗腺細胞兩個親本的標志性細胞表面標記物[14]。在這之間和以后的時間里，許多學者又對融合體做了相關研究和報道，這為本次實驗提供了一定的理論基礎。之前多名學者發(fā)現(xiàn)已分化的體細胞能夠通過重編程轉化回多能干細胞，而且通過干細胞和體細胞的細胞融合，可使體細胞重編程[15]，這在細胞移植領域具有重要意義。細胞融合致體細胞重編程速度快、效率高，是一種研究重編程機制的重要手段。本次試驗將多能MSCs與成體SGCs融合，對其融合體進行檢測看是否保留多能MSCs與成體SGCs兩者的特征，為進一步用融合細胞進過誘導培養(yǎng)分化成汗腺器官做初步研究。

我們將有限稀釋法和雙熒光標記相結合，成功挑選出干細胞與汗腺細胞融合體，這種方法使得干細胞代替有免疫缺陷的腫瘤細胞作為父代細胞應用于融合實驗。其中雙熒光標記本次實驗采用的是PKH26和CFDA-SE。PKH26作為一種紅色熒光染料，可以與細胞膜不可逆地結合，從而對細胞進行熒光標記，是一種簡便的標記細胞的方法[16-17]。CFSE（二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯）作為一種綠色熒光，是一種細胞膜穿透性熒光染料，不可逆地與細胞內(nèi)蛋白的Lysine殘基或其他氨基結合，且不會引起細胞發(fā)生凋亡或死亡[18]。這兩種染料對細胞的毒害作用小，減少了干細胞和汗腺細胞融合的不確定因素。

本次試驗中干細胞與汗腺細胞融合形成的細胞株，成功解決了再造汗腺組織工程中種子細胞嚴重缺乏這一瓶頸問題。以往實驗中干細胞轉化為汗腺細胞轉化率太低，汗腺細胞不能大量獲取，阻礙了汗腺細胞轉化為汗腺組織的實驗進程，通過本次實驗使得研究人員可以隨時通過復蘇細胞株來得到大量能分泌汗液的汗腺樣細胞，以便接下來得實驗研究。本次實驗方法雖然復雜繁瑣。但其結果融合細胞的成功篩選、鑒定已經(jīng)證明了融合技術在汗腺再生這一研究領域的可行性，為大面積重度燒傷汗腺器官重建指明了一個新的研究方向，因研究條件及研究時間的限制，本次實驗并未對干細胞/汗腺細胞的雜合細胞做進一步檢測，融合細胞是否具有致瘤性仍需進一步動物實驗來論證。

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