將實(shí)驗(yàn)豚鼠隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑高、中、低劑量組和陽(yáng)性藥組（復(fù)方卡力孜然），剪去背部黑色皮膚區(qū)毛約4×4cm²，用8%的硫化鈉脫毛，每4天1次。除正常組，其余各組在脫毛區(qū)涂5%氫醌1ml bid[1、2]，連續(xù)50d，以制備白癜風(fēng)動(dòng)物模型。正常組在脫毛區(qū)涂蒸餾水1ml bid。造模第11天，各組分別每天在涂抹氫醌后1小時(shí)涂藥，其中正常組、模型組涂溶媒（95%酒精）1ml，復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑高、中、低劑量分別涂復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑（1g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml）3次/天，1ml/次，陽(yáng)性藥組涂復(fù)方卡力孜然酊（新疆維阿堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20100802）1ml，3次/天，各組涂藥后，日光照射15min，連續(xù)給藥40d。在此期間，各組豚鼠每3d剃毛1次。

1.4試驗(yàn)方法

處死豚鼠，取皮損中心約1×1cm面積皮膚標(biāo)本，給予10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm厚）。HE染色，觀(guān)察標(biāo)本組織學(xué)的變化。用硫酸亞鐵lillie法進(jìn)行黑色染色。切片脫蠟水化，微波爐中檔10min預(yù)處理、PBS沖洗；3%H₂O₂室溫孵育10min，PBS沖洗后，一次滴加一抗鼠抗人單克隆抗體，37℃60min、PBS沖洗3次×5min，滴入生物素標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG37℃ 10 min、SABC工作液37℃ 30min，每步反應(yīng)后均以PBS沖洗3min×3次，新鮮配制的DAB溶液顯色10min，蘇木素復(fù)染3~5min，蒸餾水沖洗，脫水、透明后以中性樹(shù)膠封片進(jìn)行鏡檢。用已知的陽(yáng)性切片坐陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。CD4⁺/CD8⁺檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀，抽取各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血0.5ml。分析5000個(gè)淋巴細(xì)胞，操作嚴(yán)格按照試劑操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

TNF-a和IL-6標(biāo)記陽(yáng)性的切片為表皮細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍（40倍物鏡）視野觀(guān)察并采圖，測(cè)量光密度值。測(cè)定視野中表皮基底層中陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（`x±s）表示，采用SPSS11.0 for windows軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用單因素方差分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組和中劑量組各有1只豚鼠死亡，陽(yáng)性藥組和高劑量組各有2只豚鼠死亡，均予退出實(shí)驗(yàn)。

TNF-a和IL-6陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于表皮基底層、棘層、顆粒層，正常對(duì)照組均呈弱陽(yáng)性表達(dá)。模型組TNF-a和IL-6表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑高劑量組、中劑量組和陽(yáng)性藥組TNF-a和IL-6表達(dá)與模型組相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但低劑量組TNF-a和IL-6表達(dá)與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05）。

模型組CD4⁺含量及CD4⁺/CD8⁺比值均顯著低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑高、中劑量組和陽(yáng)性藥組CD4⁺含量及CD4⁺/CD8⁺比值與模型組相比顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但低劑量組CD4⁺含量及CD4⁺/CD8⁺比值與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05），各組CD8⁺含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P?0.05）。詳見(jiàn)表1和圖1、2.

表1：各組TNF-a、IL-6表達(dá)水平及CD4⁺、CD8⁺含量與比值比較

注：與正常組比較：*P<0.01，與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

圖1：復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)模型皮膚IL-6表達(dá)的影響

圖2：復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)模型皮膚TNF-a表達(dá)的影響

3.討論

白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制至今尚未得到完全闡明。在對(duì)其病因的探索中，自身免疫機(jī)制與本病的聯(lián)系近年來(lái)得到研究人員越來(lái)越多的關(guān)注。近年來(lái)，伴隨黑素細(xì)胞免疫學(xué)功能研究新成果的顯現(xiàn)，學(xué)者們開(kāi)始觀(guān)察白癜風(fēng)的細(xì)胞免疫學(xué)改變，即由T淋巴細(xì)胞執(zhí)行特異性免疫功能所引發(fā)的黑素細(xì)胞受損。有研究表明[2]：白癜風(fēng)患者外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)存在異常，CD4⁺/CD8⁺比值下降。活動(dòng)性白癜風(fēng)患者尤其是非節(jié)段型患者的外周血中CD4⁺細(xì)胞顯著減少，尤其是泛發(fā)型患者同時(shí)還伴有CD8⁺細(xì)胞數(shù)量的增加。對(duì)此有學(xué)者認(rèn)為外周CD4⁺細(xì)胞數(shù)量下降局部細(xì)胞發(fā)生CD4⁺細(xì)胞遷移和局部集中的結(jié)果。本次研究顯示，模型組CD4⁺/CD8⁺比值顯著低于正常對(duì)照組，也印證了既往研究的結(jié)果。

白癜風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展與自身免疫系統(tǒng)各個(gè)方面、各個(gè)環(huán)節(jié)存在密切的聯(lián)系。甚至其他致病因素，如氧化應(yīng)激機(jī)制，遺傳機(jī)制，也可能有免疫因素的參與。而機(jī)體的免疫應(yīng)答大部分經(jīng)由細(xì)胞因子調(diào)控，所以細(xì)胞因子與白癜風(fēng)的發(fā)病關(guān)系就顯得尤為重要。

既往研究顯示[3]，白癜風(fēng)患者皮損區(qū)域促使黑色素細(xì)胞凋亡和破壞的細(xì)胞因子TNF-a與IL-6水平大幅升高，顯示二者可能在白癜風(fēng)的發(fā)病中起到了一定的促進(jìn)作用。

TNF-a是由單核-巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞合成并分泌的一種細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等生物效應(yīng)。TNF-a一方面是人體的不可或缺的防御介質(zhì)，另一方面也可能導(dǎo)致機(jī)體的免疫性損傷，引發(fā)一系列自身免疫性疾病。TNF-a還是一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子。研究人員應(yīng)用免疫組化、原位雜交技術(shù)對(duì)白癜風(fēng)患者外周血T細(xì)胞TNF-a的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示白癜風(fēng)患者外周血T細(xì)胞TNF-a表達(dá)水平顯著增加，提示TNF-a可能在白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中起一定作用；且黑素細(xì)胞膜表面存在TNF-a受體，由此進(jìn)一步推測(cè)TNF-TNR途徑可能參與了黑素細(xì)胞的凋亡[4]。

有研究顯示[5]，TNF-a可使黑素細(xì)胞出現(xiàn)顯著的形態(tài)學(xué)改變，使細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、兩極化變化。同時(shí)用不同濃度的TNF-a與黑素細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示不同濃度的TNF-a均對(duì)黑素細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了一定的抑制效應(yīng)。且濃度越高抑制作用越顯著，即表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性。

IL-6是一種可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)的刺激因子，在某些疾病的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用。有研究顯示[6]，白癜風(fēng)患者在治療前血清IL-6水平顯著高于對(duì)照組，治療3個(gè)月后與對(duì)照組比較仍有顯著性差異。白癜風(fēng)患者IL-6升高的機(jī)制可能是其體內(nèi)的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)遭到破壞，使可持續(xù)分泌IL-6及與IL-6受體結(jié)合的刺激細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚局部損害。

綜上所述，白癜風(fēng)病因較為復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外眾多研究都支持本病是一種自身免疫性疾患，皮損區(qū)和外周血中細(xì)胞因子的水平改變引發(fā)了免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生和進(jìn)展。從細(xì)胞因子層面深入研究白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理，探尋特異性地可觀(guān)指標(biāo)，無(wú)疑有助于判斷該病的活動(dòng)性及嚴(yán)重度，為提高其臨床診療水平帶來(lái)新的希望[7]。

本次研究顯示，復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑高、中劑量組和陽(yáng)性藥組TNF-a及IL-6表達(dá)與模型組相比明顯下降，復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑高、中劑量組和陽(yáng)性藥組CD4⁺/CD8⁺比值與模型組相比顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑可明顯降低TNF-a及IL-6的表達(dá)，改善患者細(xì)胞免疫的異常狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)白癜風(fēng)實(shí)現(xiàn)一定的治療作用。改療法值得在臨床上進(jìn)一步研究、推廣。

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